胰島素抵抗(IR)是在慢性非傳染性疾病（高血壓、冠心病、糖尿病）與增齡過程中廣泛存在的重要病理生理改變，表現(xiàn)為體內(nèi)循環(huán)中胰島素濃度不低于正常水平而其生物效應(yīng)低下的狀態(tài)。
    由于以人為對象進行胰島素敏感性(IS)的研究受到較大的限制。因此，通過改變實驗條件誘發(fā)動物IS改變，建立相應(yīng)的動物模型已成為IS研究的重要方法。有證據(jù)表明攝食量與成分的變化可以導致機體血漿胰島素水平及IS的變化，如由于飲食原因引起單純性肥胖時出現(xiàn)的IR，以及熱量限制時出現(xiàn)的胰島素水平下降等。本研究選擇改變飼料攝入量與攝人成分的實驗條件，模擬攝食習慣變化對代謝影響的狀態(tài)，建立了以不同飼料配方與喂飼方式誘導IS改變的大鼠模型。對于IR在體研究具有一定的應(yīng)用意義。
材料與方法
一、材料
    1．實驗動物：雄性SD大鼠132只，初始體重(198±14)g，購自中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗室。
    2．動物飼料：(1)正常基礎(chǔ)飼料：普通商用基礎(chǔ)塊料，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。(2)高脂高能量飼料：在參考文獻[5]基礎(chǔ)上調(diào)整配方，提高脂肪供熱量至59%，并相應(yīng)調(diào)整其他成分含量。由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所制備。兩種飼料成分及能量對比見表1。
二、實驗方法
    1．動物分組與飼養(yǎng)：132只雄性SD大鼠分為三組，每組3個時間段，每個時間段用14只大鼠，7只用于鉗夾試驗，7只用于OGTT和其他檢測，每組有2只機動備用。各組大鼠均喂飼6個月，喂飼方式如下：(1)對照組：喂飼普通商用基礎(chǔ)塊料，自由攝食飲水；(2)肥胖組：喂飼高脂高能量塊料，自由攝食飲水,(3)限食組：為從喂飼高脂高能飼料至2個月時分出再喂飼普通商用基礎(chǔ)塊料，單籠(33cmX22 cmX13 cm)喂養(yǎng)，自由飲水，但限制食量為同齡大鼠每日進食量的60%（約為16 g/d，40%的熱卡限制）。每日稱量投放的飼料。大鼠每周稱體重。三組大鼠在喂飼至2、4、6個月時采用正常血糖一高血漿胰島素鉗夾試驗檢測IS并進行口服糖耐量試驗( oGrrT)，同時檢測大鼠體重、內(nèi)臟體脂重量及空腹血漿胰島素( FIns)水平。
    2．正常血糖一高胰血漿島素鉗夾試驗：鉗夾試驗前一天下午大鼠用14%水合氯醛膠漿進行腹腔內(nèi)注射麻醉(0.3 ml／l00g體重)。插管術(shù)后第二天上午進行鉗夾實驗，操作過程見參考文獻[6]，取最后五次葡萄糖輸注速率( GIR)的平均值作為反映大鼠IS的指標。
    3．OGTT:大鼠按2g葡萄糖/kg體重計算灌服相當計量的50%葡萄糖水，分別在服糖前及服糖后15、30、60、120 min時從尾部取血測定血糖值。
    4．大鼠血標本采集測定及內(nèi)臟脂肪質(zhì)量測定：各組OGTT后48 h的大鼠斷頭處死，肝素抗凝取血，取上清貯存于-80℃冰箱。血漿胰島素采用放射免疫法測定。取左側(cè)附睪周圍的全部脂肪，稱其濕重為內(nèi)臟脂肪質(zhì)量。
三、統(tǒng)計學處理
    所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(r±s)表示，各項結(jié)果運用SAS統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)。
結(jié)  果
一、不同飼料配方及喂飼方式對大鼠體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量的影響
    使用不同飼料及采取不同的方式喂飼后，大鼠的外部體態(tài)、體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量等方面都有不同程度的變化（表2）。至實驗結(jié)束時肥胖組大鼠體重顯著高于對照組；而限食組大鼠體重顯著低于其他各組。限食組大鼠體重與限食前相比減低了28.4%，與同齡對照組、肥胖組相比分別減低了47.9%和52.3%；
    飼料顆粒機、秸稈顆粒機是養(yǎng)殖戶們生產(chǎn)顆粒飼料很好的選擇。
二、不同飼料配方及喂飼方式對大鼠IS的影響
    在實驗結(jié)束時，兩種飼料及兩種不同喂飼狀況大鼠的IS由高到低依次為：限食組>對照組>肥胖組（圖1）。對照組大鼠的IS喂飼4個月中無明顯變化，但至6個月時下降了52.3% (P<0.01)。肥胖組大鼠2個月時就已出現(xiàn)IS明顯下降，并隨喂飼時間延長而不斷下降，與同齡對照組大鼠相比，2個月、4個月、6個月時分別低了55.O%、59. 5%、58.0% (P<0.01)。與同齡對照組及肥胖組大鼠相比，限食組大鼠IS始終維持在高敏狀態(tài)(P<0. 01)，實驗結(jié)束時限食組大鼠IS是肥胖組大鼠的10倍以上。
    三、不同飼料配方及喂飼方式對大鼠OGTT結(jié)果的影響
    不同飼料及喂飼狀態(tài)的大鼠出現(xiàn)不同的OG-TT結(jié)果（圖2）。對照組大鼠喂飼2個月、4個月時OGTT結(jié)果正常，實驗結(jié)束時超出正常值范圍，表現(xiàn)為糖耐量受損肥胖組大鼠喂飼2個月時服葡萄糖2h后血糖值(2 hPG)已表現(xiàn)為糖耐量受損，實驗結(jié)束時糖耐量受損程度進一步加重。限食組大鼠OGTT始終維持在正常狀態(tài)，實驗結(jié)束時空腹血糖水平(FPG)和2 hPG在各組中最低。
四、不同飼料配方及喂飼方式下大鼠Flns水平
    在6個月的喂養(yǎng)過程中，各組大鼠FIns變化見表3。對照組與肥胖組大鼠FIns在喂飼過程中均有增長趨勢；肥胖組大鼠FIns的增長趨勢較同齡對照組大鼠水平為高，但差異無統(tǒng)計學意義。喂飼過程中，限食組大鼠Flns顯著低子其他兩組大鼠(P<0.05)。
    五、不同飼料配方及喂飼方式模型的成功率
    以高血漿胰島素一正常血糖鉗夾試驗測定IS的結(jié)果與預期結(jié)果的吻合率判定本模型制備的成功率。本實驗中共58只大鼠實施了鉗夾測定，獲得了53只大鼠的實測結(jié)果(鉗夾實驗成功率91.4%)，其中僅有2只的鉗夾測定結(jié)果與該組大鼠試驗預期結(jié)果方向不一致，模型的成功率達到96.2%。
    討  論
    飼料質(zhì)量和數(shù)量與機體代謝狀態(tài)密切相關(guān)，從而影響機體的IS及血漿胰島素水平，其中飼料質(zhì)量的影響尤為重要。本研究中使用的高脂高能飼料參考了已發(fā)表的配方，在不改變原配方蛋白含量并能加工成固體飼料的原則下，加大了脂肪比例。與普通商用飼料相比，能量高出40.5%；其中57. 9%的熱量由脂肪提供，脂肪提供總能量比普通商用飼料的12. 8%提高了3倍。這是導致食用這種飼料大鼠迅速出現(xiàn)體重增加，體脂堆積，IS下降和糖耐量受損的主要原因。以普通商用飼料不加限制的自由進食方式喂養(yǎng)的對照組大鼠，隨喂飼時間延長，在大鼠基本完成生長發(fā)育之后，也出現(xiàn)了體內(nèi)脂肪堆積和IS下降，提示在飲食充足、無控制狀態(tài)的進食情況下，大鼠也會隨著時間推移出現(xiàn)體脂積累，肥胖狀態(tài)發(fā)展，并由此造成IS下降等代謝紊亂現(xiàn)象。這點與人的通常情況相似。
    高脂高能量飼料喂飼2個月后用自身對照的方式對這組中的部分大鼠用普通商用飼料進行限食，每只每天食量攝入限定為對照組大鼠攝食量的60%左右。限食大鼠一般狀態(tài)良好，體重明顯降低，體脂蓄積明顯減少，IS大幅度升高，對糖負荷保持了良好的應(yīng)對狀態(tài)。提示適量的減低能量攝入，不僅能維持機體對胰島素的良好敏感狀態(tài)，還可以逆轉(zhuǎn)高脂高能量飼料造成的IR，恢復機體對糖負荷的一定承受能力，這與限食可以維持良好生理機能，減低疾病發(fā)生的報道相一致。
    既往的報道多為高脂飼料喂養(yǎng)或直接靜脈輸入脂肪類物質(zhì)誘導的IR動物模型。本研究中使用的2種飼料配方及2種喂飼方法，快速經(jīng)濟易行，成模率高(>90%)，經(jīng)胰島素鉗夾試驗證實可以成功地制備出穩(wěn)定、可靠的不同IS的大鼠模型。用此模型模擬IS變化的自然過程、研究IS不同狀態(tài)（降低和升高）的機制和IR的干預措施是完全可行的。目前ATⅡ水平的升高，其中以心肌局部ATⅡ升高更為明顯。心肌ATⅡ不僅可由ACE途徑生成，還可由糜蛋白酶途徑生成。糜蛋白酶是一種糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，倉鼠、狗和人體內(nèi)的糜蛋白酶屬于a-糜蛋白酶，可裂解ATI分子中的Phe8-His9肽鍵而生成ATⅡ，多項體內(nèi)和體外研究均證實，糜蛋白酶在冠狀動脈粥樣硬化、心室肥厚、心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病倉鼠心肌局部糜蛋白酶mRNA表達顯著升高，而ACE mRNA表達無顯著變化，提示心肌局部升高的ATⅡ可能來源于糜蛋白酶途徑。與本實驗的研究結(jié)果相似，Shiota等發(fā)現(xiàn)，兩腎一夾(2KIC)倉鼠心肌纖維化的發(fā)生是糜蛋白酶活化的結(jié)果，而與ACE無關(guān)。
    研究還發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶還可通過促進心肌局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生和心肌局部基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) c10]的活化而加重心肌纖維化的發(fā)生和心肌病變的進程，這可能也是糜蛋白酶參與糖尿病心肌病變發(fā)生的機制之一。
    總之，本實驗通過腹腔注射STZ成功誘導了糖尿病心肌病變倉鼠動物模型，并發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病變時伴有心肌局部ATⅡ水平的增高和糜蛋白酶基因表達的增強，提示糜蛋白酶可能參與糖尿病心肌病變的發(fā)生和發(fā)展，抑制糜蛋白酶的表達或活性可能具有治療作用。